棱光紫外可見分光光度計(jì)是實(shí)驗(yàn)室常用的分析儀器，而棱光（棱鏡/光柵型）分光光度計(jì)因其高精度和穩(wěn)定性，在科研、制藥、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。然而，要獲得準(zhǔn)確的吸光度數(shù)據(jù)，需要掌握正確的操作方法和優(yōu)化技巧。本文將詳細(xì)介紹使用它測量溶液吸光度的關(guān)鍵步驟和注意事項(xiàng)，幫助實(shí)驗(yàn)人員提高測量精度。
一、測量前的準(zhǔn)備工作
1.儀器預(yù)熱與校準(zhǔn)
-預(yù)熱時(shí)間：棱光分光光度計(jì)的光源（氘燈、鎢燈）和檢測器需要穩(wěn)定，通常開機(jī)后預(yù)熱15-30分鐘，確保基線平穩(wěn)。
-基線校正：使用空白溶劑（如純水或緩沖液）進(jìn)行基線掃描，扣除背景干擾。
-波長校準(zhǔn)：使用標(biāo)準(zhǔn)濾光片（如鈥玻璃）檢查波長準(zhǔn)確性，確保儀器光學(xué)系統(tǒng)正常。
2.樣品處理
-選擇合適的溶劑：確保溶劑在測量波長范圍內(nèi)無吸收（如測定DNA時(shí)避免使用在260nm有吸收的Tris緩沖液）。
-樣品濃度優(yōu)化：吸光度（A）應(yīng)在0.1-1.0之間（符合比爾定律線性范圍），過高需稀釋，過低可增加光程（如使用10mm比色皿改為20mm）。
-過濾或離心：若樣品渾濁或有顆粒，需用0.22μm濾膜過濾或離心，避免光散射干擾。
二、測量過程中的關(guān)鍵技巧
1.比色皿的正確使用
-材質(zhì)選擇：
-石英比色皿：適用于紫外區(qū)（190-350nm），不可用于強(qiáng)酸/強(qiáng)堿。
-玻璃比色皿：僅適用于可見光區(qū)（350-800nm），成本較低。
-清潔與放置：
-使用前后用溶劑（如乙醇）清洗，避免指紋或殘留影響透光率。
-放入樣品池時(shí)，確保光面（磨砂面為手持面）對準(zhǔn)光路，避免角度偏差。
2.參數(shù)優(yōu)化
-狹縫寬度：
-狹縫越窄，分辨率越高，但光通量降低，信噪比下降。通常選擇1-2nm平衡靈敏度和分辨率。
-掃描速度：
-快速掃描（如1200nm/min）適合初步篩查，慢速掃描（如60nm/min）可提高數(shù)據(jù)精度。
-積分時(shí)間：
-低濃度樣品可適當(dāng)延長積分時(shí)間（如0.5-1秒），提高信號(hào)穩(wěn)定性。
3.避免常見誤差來源
-雜散光干擾：
-高濃度樣品（A>2.0）易受雜散光影響，需稀釋后測量。
-溶劑揮發(fā)：
-揮發(fā)性溶劑（如甲醇）需加蓋測量，或使用帶蓋比色皿。
-溫度影響：
-溫度敏感樣品（如酶反應(yīng)體系）建議使用恒溫比色皿架。
三、數(shù)據(jù)后處理與驗(yàn)證
1.基線扣除
-若空白溶劑與樣品基質(zhì)不同（如含蛋白質(zhì)的緩沖液），需使用相同基質(zhì)的空白校正。
2.多波長測量
-對復(fù)雜體系（如混合物），可掃描全波段（如200-800nm），結(jié)合導(dǎo)數(shù)光譜或峰擬合提高分析準(zhǔn)確性。
3.重復(fù)性與統(tǒng)計(jì)
-每個(gè)樣品至少測3次，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），RSD>5%需檢查操作或儀器狀態(tài)。
四、日常維護(hù)與故障排查
1.光源壽命管理：
-氘燈壽命約1000小時(shí)，若能量下降或基線噪聲增大需更換。
2.光學(xué)系統(tǒng)清潔：
-定期用無水乙醇擦拭比色皿窗口，避免灰塵或樣品殘留。
3.常見問題處理：
-基線漂移：檢查電源穩(wěn)定性或光源老化。
-噪聲過大：確認(rèn)比色皿潔凈或狹縫寬度是否合適。
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